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免疫共沉淀及WB检测方案

发布时间:2019-08-23 09:55分享:

实验材料:

  Mouse, Rabbit 或Goat IgG TrueBlot™

  TrueBlot™ Ig IP 微球 or Protein A 或 G 微球

实验设备:

  SDS-PAGE电泳及转膜相关设备和缓冲液;

  微量移液器;

  摇床;

  PVDF或nitrocellulose膜;

  WB结果检测设备及底物

实验步骤

  1). 免疫共沉淀(IP)和SDS-PAGE电泳

  (1) 细胞裂解:往107/ml细胞中加入适量预冷的细胞裂解液和蛋白酶抑制剂,混匀4度孵育30-60分钟后10000g离心15min,保留上清液。布氏法检测蛋白浓度后,将样品稀释为1μg/μl左右。可-80度冻存或继续下一步。

  (2) 细胞裂解物的预清洗:加50ul之前用裂解液稀释的相应种属Ig IP Beads(or Protein A/G beads)到装有500ul细胞裂解物的离心管中,冰上孵育30-60分钟;2500×g离心2-3分钟后把上清液(不能带沉淀微球)转移到新的离心管中。

  (3) 免疫共沉淀:在装有预清洗后的细胞裂解物的离心管中加入1-10ug的一抗,4°C孵育 1-2小时或者摇晃过夜。再加入50ul用裂解液预处理过的Ig IP Beads(or Protein A/G beads),4°C混匀孵育1-2小时或摇床过夜后2500×g离心0.5分钟(可以和一抗一起孵育)。尽量完全地移去上清液并用500ul预冷的裂解液洗涤3次(每次都要离心弃完上清,有利于降低背景)。

  (4) 最后一次洗涤并小心的吸掉上清液后,加入50ul 1X Laemmli sample buffer(或含50mM DTT的SDS Sample Loading Buffer)(注意Sample Loading Buffer成分必须含有还原剂)。Vortex混匀后加热至90-100℃,10分钟。10000×g离心5分钟,小心收集上清。10-30ul上样电泳,避免上样Beads。

  注:收集的上清液可以置于-20°C保存。用时解冻后,加入新鲜的DTT并加热至90-100℃十分钟。10000×g离心5分钟,收集上清进行上样电泳。

  2). 免疫印迹(Western Blotting)

  (1) 如前所述SDS-PAGE电泳结束。

  (2) 把蛋白质从SDS聚丙烯酰胺凝胶转移至NC膜上。丽春红-S染色鉴定是否转膜成功,考马斯亮蓝对SDS-PAGE进行染色分析转膜效率,蒸馏水或TBST清洗丽春红。

  (3) 在通风柜里,将NC膜在True Blot enhancer buffer 浸泡2min,TBST清洗一次。

  (4) 将NC膜浸入5%的脱脂奶粉的封闭液中,置于摇床上室温封闭2小时。

  (5) 弃去封闭液后,加入靶蛋白一抗(用5%脱脂奶粉封闭液稀释,终浓度需要预实验摸索,建议1-2ug/ml)。置于摇床上室温孵育2小时或者4℃孵育过夜。

  (6) 用TBST洗涤膜4-5次,每次5-10分钟。

  (7) 弃去洗液后加入适量的用5%脱脂奶粉封闭液稀释好的TrueBlot™(稀释比为1:1000),室温孵育1小时。

  (8) 用PBST或TBST洗涤膜4-5次,每次5-10分钟。

  (9) 用合适的过氧化物酶HRP化学发光底物并按照说明(等量的底物A+底物B)进行显色反应。

  (10) 在暗室中用X光片曝光,根据结果调整曝光时间(10sec、1min、5min和20min)和曝光区域,以得到最佳效果。

  3). 注意事项

  (1) 免疫共沉淀抗体的稀释:用于免疫共沉淀的抗体在使用之前需要进行稀释,例如使用浓度为1-5ug/107细胞/ml。一般对于从107细胞裂解出的大部分蛋白抗原来说,加入2ug抗体就足够了。因为尽量减少抗体用量可以降低还原性沉淀抗体对SDS-PAGE电泳样品检测的干扰。(TrueBlot™并不能增强免疫印迹中抗体和抗原之间的特异性结合,所以如果用于WB的抗体能与非目的蛋白产生交叉反应,结果也会被TrueBlot™检测出来)

  (2) WB的封闭:Mouse, Rabbit 和Goat IgG TrueBlot™检测过程中的膜封闭,一抗稀释孵育和TrueBlot™稀释孵育过程都建议使用5%(w/v)的脱脂奶粉液。BSA不建议使用于此过程。

  (3) 阳性对照:Mouse, Rabbit 和Goat IgG TrueBlot™检测SDS-denatured, non-reduced mouse IgG,所以可用20ng non-reduced沉淀抗体直接上样电泳,然后WB作为IgG TrueBlot™的阳性对照。

  (4) 阴性对照:WB过程中不加一抗,直接加二抗TrueBlot™ beads。

  (5) SDS-PAGE电泳及WB:Mouse, Rabbit 和Goat IgG TrueBlot™检测过程为用含适量抗氧化剂上样液电泳,然后Poncean S预染和20%的乙酸/30%甲醇脱色;再室温自然晾干1小时,用含甲醇的Buffer A润膜后封闭。这个操作过程可以得到很好的WB结果,PVDF膜或硝酸纤维膜都适用于此检测过程。

  4).相关缓冲液配方:

  2X SDS Reducing Sample Loading Buffer (包含50 mM DTT)

  950 mL 2X SDS sample buffer

  50 mL 1M DTT

  注: 1小时内使用,过期丢弃。.

  2X SDS Sample Buffer

  6% SDS

  25mM Tris base pHed to 6.5 with HCl

  10% glycerol

  Bromphenol blue

  注: -20°C长时间储存 ,室温最多只能储存一月。

  TBS-Tween (TBS-T):

  25 mM Tris-HCl, pH 8.0

  125 mM NaCl

  0.1% Tween 20

  Blocking Buffer:

  5g 脱脂奶粉

  100ml TBS-T

  调整PH值为7.4

  Antibody Binding Buffer:

   含1% 脱脂奶粉 TBS-T

  Protease Inhibitor Cocktail (100X):

  PMSF, 5mg (50μg/ml)

  Aprotinin, 100μg (1μg/ml)

  Leupeptin, 100μg (1μg/ml)

  Pepstatin, 100μg (1μg/ml)

  Phosphatase Inhibitor (100X):

  1mM Na3VO4

  1mM NaF

  注: IP: Immunoprecitaton免疫共沉淀. WB: Western Blot蛋白质印记

参考文献:

1. Alegria-Schaffer A, Lodge A, Vattem K. 2009. Performing and optimizing Western blots with an emphasis on chemiluminescent detection. Methods Enzymol. 2009;463:573-99.

2. Haan C, Behrmann I. 2007. A cost effective non-commercial ECL-solution for Western blot detections yielding strong signals and low background. J Immunol Methods. Jan 10;318(1-2):11-9.

3. Immunoblot affinity purification. 2005. Nature Methods 2, 797 – 798.

4. Uhlig U, Uhlig S, Branscheid D, Zabel P, Vollmer E, Goldmann T. 2004. HOPE technique enables Western blot analysis from paraffin-embedded tissues. Pathol Res Pract. 2004;200(6):469-72.

5. Wu M, Stockley PG, Martin WJ 2nd. 2002. An improved western blotting technique effectively reduces background. Electrophoresis. Aug;23(15):2373-6.

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