PLGA-b-PEG纳米载药平台系列介绍之一：PLGA-b-PEG共聚物的起源，合成及物化性能

近年来，聚合物被大量的应用于纳米医学，尤其是药物递送中。采用聚合物作为药物载体可以解决药物在水中的溶解性差、不易被活体吸收、活体内循环时间短以及副作用较强等问题。聚合物纳米药物载体具有良好的亲水性，能够通过毛细管穿透组织，并且到达靶组织，进入细胞。另外，在聚合物纳米药物载体表面可以通过表面官能团修饰上特殊的蛋白、肽、单克隆抗体，选择性地结合在特殊靶组织，较低与正常细胞的相互作用，从而降低毒副作用，增加药物摄取效率。在活体应用中，聚合物纳米药物载体的尺寸控制非常重要的。非常小的纳米粒子，平均尺寸<10 nm会很快被肾脏排泄，大的粒子（200 nm以上）会被肝或脾脏大量摄取，只有粒子尺寸在10-200 nm之间是体内应用的最佳尺寸。【1】同时，纳米载体表面要通过修饰形成较厚的水化层，并且电荷接近电中性，才有利于实现体内稳定和长循环。最为关键的一点是在活体应用中，要求所采用聚合物等材料必须具有良好的生物相容性、合适的生物可降解性，甚至具有刺激响应释放特性。

聚乳酸乙醇酸共聚物（PLGA）是一个最为广泛研究的聚合物，能够完全的生物降解，并且能够自组装成纳米尺寸的胶束，将小分子包裹住。然而，PLGA聚合物纳米粒子在活体里应用仍然具有很多挑战，PLGA在水中的溶解性比较差，形成的纳米粒子尺寸较大，这些纳米载体很容易被肝和脾脏清除，从而降低了肿瘤组织中的药物浓度。聚乙二醇（PEG）是药物递送应用中使用最多的聚合物，第一个PEG化的产品已经在市场上有超过20年的应用。由于PEG不会被免疫系统识别，通常会延长纳米载体在体内的循环时间。另外PEG是亲水性非常好的高分子，能够形成较厚的水化层，通过空间位阻作用稳定纳米粒子。本文作为系列文章之一，首先分别介绍PLGA与PEG两种高聚物，随后介绍PLGA-b-PEG共聚物的合成以及物化性质，最后介绍制备PLGA-PEG纳米载体的常用方法，以及与单独的PLGA及PEG高聚物相比的优缺点。

聚乳酸乙醇酸共聚物（PLGA）

PLGA是聚乳酸（PLA）及聚乙醇酸（PGA）的共聚物。PLGA的降解速度与PLA和PGA的摩尔比例有关。PLA：PGA两个单体的摩尔比率为50：50时，降解速度是最快的。另外分子量也会影响PLGA的降解速度，通常使用的分子量为5-150 kD。使用PLGA的最大优势是这个共聚物在水溶液介质中可以完全被降解。在体内，PLGA会被降解并以CO2和H2O的形式排出，或者以小分子形式被肾脏排出。由于这一优秀的性质，PLGA从1970年开始就成为生物医学界中应用最为广泛的高聚物。FDA已经批准PLGA为药物递送载体，除此之外还可以作为医学支架和导管。然而PLGA作为纳米载体还是很容易被肝脏和脾脏的网状内皮系统（RES）从血液循环中清除，因此极大地降低了纳米粒子在血液中的循环时间，并减低在靶器官的累积。

聚乙二醇（PEG）

PEG是一种非离子型亲水性聚醚，由单体乙二醇合成。目前分子量分布从300 Da-100KDa之间。PEG在医学中有各种的应用，可以作为泻药进行口服，也可以作为药物的辅剂，或者作为一种涂层。PEG不能发生生物降解，但是PEG生物相容性非常好，尤其对于小分子量的PEG不会在生物组织中累积。PEG的亲水性很好，因此PEG可以用来在水溶液中稳定纳米粒子。另外PEG并没有离子型单体，因此并不会与带电荷的生物分子如DNA相互作用。PEG包裹的药物和纳米载体就如披上一件隐身衣可以避免RES的清除，增加血液循环时间。另外，PEG化的产物可以增加实体瘤的高通透性和滞留效应，即EPR效应。

PLGA-b-PEG共聚物

Gref等首先在1994年描述了在PLGA微球外部包裹PEG的药物动力学研究【2】。作者发现在PLGA纳米粒子上包覆PEG聚合物后极大地增加了这些微粒的循环时间。在注射2h后，仅有30%被肝脏捕获。然而在纳米粒子表面包裹一些PEG的片段并不足以稳定粒子，更需要有一个共聚物，具有很强的共价键来获得高的PEG表面覆盖度。因此PLGA-PEG共聚物被广泛地研究。基于PLGA和PEG的不同种共聚物被合成，例如，双单元、三单元或者多个单元的共聚物。同时，线性、支状以及混合的共聚物，尾部具有官能团或者不具有官能团的共聚物都被研究。其中最多的是双单元共聚物（PLGA-b-PEG）由于其两亲性及易合成性，尤其引起人们的兴趣。PLGA-b-PEG同时具有生物可降解性、生物相容性以及PEG的隐蔽性，同时两亲性使得PLGA-b-PEG很容易发生自组装，使得疏水端PLGA在胶束的内部，PEG在胶束的外侧，从而形成一个稳定的高分子胶束结构。PEG链可以接上各种活性基团，如氨基、羧基、甲氧基、马来酰亚胺基团等。功能化的PEG链更容易偶联活性分子如蛋白、多肽、单克隆抗体等用于靶向特定组织。

PLGA-b-PEG的合成通过带有羧基的PLGA-COOH与双官能团的PEG，如NH2-PEG-OMe进行共价偶联形成。PLGA-COOH首先通过在二氯甲烷中通过DCC和NHS活化，随后与双官能团PEG发生偶联反应。在反应过程中最重要的是要除去所有未结合的PEG。另外一种方法可以通过带有PEG的乳酸和乙醇酸进行聚合，但是这种方法也可能形成另外一种高聚物，也就是所谓的(AB)n型多单元共聚物，而不是AB型双单元共聚物。

图1. PLGA-b-PEG共聚物合成示意图【1】。

PLGA-b-PEG纳米载体的制备

纳米沉淀法及油水（O/W）乳化法是最适合形成PLGA-b-PEG纳米载体的两种方法。在纳米粒子形成过程中，一些脂溶性的药物分子，或者小的脂溶性纳米粒子容易被嵌入在PLGA内核中，形成表面包覆PEG的纳米载药系统。

纳米沉淀法首先会形成小的核，然后在这些核上聚集大分子而形成纳米粒子。这一过程并不是有序的组装，因此不需要特殊的高聚物，来获得好的悬浮性及可控性。在这一过程中需要将高聚物溶解于水溶性的有机溶剂中，例如丙酮、四氢呋喃、DMSO、乙腈、DMF等，再将脂溶性药物或者其他需要包载的有机物溶于其中，然后将该混合物加入水或添加表面活性剂的水溶液中并剧烈搅拌。当高聚物接触到水时立刻成核，并且沉积生长直到纳米粒子稳定性足够。PLGA纳米粒子中含有的有机溶剂可以通过旋蒸去除。PLGA-b-PEG由于具有两亲性单元会形成核壳结构。PLGA链在纳米粒子的内部形成胶束内核，包载了酯溶性药物，而PEG链伸展到水相可以作为功能性基团。采用这种方式形成的纳米粒子尺寸会比较小（20-250 nm），且分散性较好。在纳米沉淀法中，溶剂及水的相互溶解性会影响纳米粒子的尺寸。溶剂在水中的溶解性增加，纳米粒子的尺寸会减小，例如DMF可以获得最小尺寸的纳米粒子。

另一种适合形成PLGA-b-PEG纳米粒子的方法为油水乳化法。将高聚物以及酯溶性药物溶解到挥发性的与水不相溶的有机相如氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯或者其它溶剂中，并将其作为油相分散到外水相中，再利用超声乳化形成纳米结构的水包油小液滴，最后通过旋蒸去除有机相，从而获得载脂溶性药物的高分子胶束纳米结构。通过调整一些参数如聚合物分子量、浓度、溶剂/水比例等，可以有效调节纳米粒子的尺寸（几十至几百纳米）。例如，增加聚合物的浓度会导致纳米粒子体积的增大。 

图2. 形成包载脂溶性药物或者水溶性药物的PLGA-b-PEG纳米载体示意图【3】。

通过水/油/水复乳蒸发法可获得包载水溶性药物分子的PLGA纳米粒子。在这一过程中，水溶性药物首先溶解在水相中（W1），通过和水不相溶的有机溶剂，如二氯甲烷或氯仿超声形成W1/O乳液，有机相为连续相；当更大量的第二的水相（W2）加入时，就会获得W1/O/W2的双层乳化结构，第二个水相通常会含有稳定剂PVP等以稳定纳米结构。在第二次乳化过程中，油相仍然被镶嵌在两个水相中，通过旋蒸去除有机溶剂，就形成了含有内水相的胶囊结构。PLGA-b-PEG易形成尺寸更小的纳米粒子，延长循环时间。PLGA-b-PEG最初用于蛋白及水溶性小分子药物的包载，后来开始用于包载水溶性的RNA片段，用作基因递送治疗。PLGA-b-PEG对RNA的包载率比其他高聚物更高，并且不会降解RNA。

图3. 水/油/水复乳法形成二单元聚合物胶囊示意图【4】。

PLGA-b-PEG纳米粒子的纯化过程比较复杂。在纯化过程中若不含有稳定剂，高速离心会对所形成纳米粒子的尺寸发生影响。采用高速离心（10000 rpm）离心10分钟后重悬纳米粒子，尺寸会增加20-30%。若采用低速超滤的方式可以避免这一问题，但是保护剂就不能完全地除去，也可能会对进一步的表面修饰产生影响。因此需要经验性地控制纯化的条件。PLGA-b-PEG纳米粒子的长期储存也是比较复杂。若将PLGA-b-PEG纳米粒子存储在水体系中并不稳定，最好是将纳米粒子进行冻干长期保存。

PLGA-b-PEG纳米载体的优缺点

在上面已经提到PLGA-b-PEG纳米载体具有生物相容性好、生物可降解、较长的体内循环时间、可以避免RES的清除等优点。PLGA-b-PEG也具有显著的缺点限制了载药纳米粒子的工业化生产。首先是原料昂贵，PLGA-b-PEG由PLGA-COOH与NH2-PEG-X合成，这两种原料都是合成的高聚物，其纯度以及共聚物单元的构建与纯化步骤都会影响最后产物的质量。其次是PLGA-b-PEG原料的纯度及稳定性。在PLGA50/50中LA和GA的摩尔比是1：1，在进行无规共聚的时候就会很容易出现链段中局部形成数个GA互相连接（LA-GA-GA-GA...-LA)在一起的情况，由于PGA具有更亲水性，几个GA互相连接时，一些溶解性差的溶剂例如丙酮、乙酸乙酯和四氢呋喃就不能很好的溶解PLGA50/50，溶解性高一些溶剂如二氯甲烷、氯仿可以完全溶解PLGA50/50。若GA互相连接的数量更多，二氯甲烷也无法溶解。同时，PEG的加入使得PLGA-b-PEG很容易吸潮，从而发生降解。在进行PLGA-b-PEG纳米载药平台搭建的过程中，我们尝试过市面上很多家的原料，各家原料的产品形态、在二氯甲烷中的溶解性、纯度以及最后形成纳米载体的效率千差万别。对原料进行很好的评估并进行实验方案的调整方能获得较为理想的纳米载药粒子。

在本期的介绍中，我们主要是讨论了PLGA-b-PEG纳米粒子相关的一些物化性能及制备方法，优缺点及原料的注意点，在下期的介绍中，我们将对PLGA-b-PEG纳米载药平台的一些生物医学应用场景进一步的讨论和介绍，敬请关注。