IEEE-NANO 2019收录东纳生物快速荧光定量平台 检测沙门氏菌新成果

沙门氏菌是一种革兰氏阴性菌，其包含超过2,600种能够在多种宿主中引起感染的血清型。该菌是胃肠道感染的最常见原因之一，沙门氏菌的感染源主要包括牛奶，鸡蛋，肉类（家禽，牛肉），蔬菜和新鲜水果。每年导致全球数以千万计的感染病例。在加拿大，沙门氏菌是最常见的食源性疾病的病原菌。在每年发生的400万例食源性疾病中，非伤寒沙门氏菌占加拿大报告感染的约41％。欧盟每年报告超过100,000例沙门氏菌病，其中人类沙门氏菌病的费用每年估计高达30亿欧元。在美国，由于受沙门氏菌污染的食物来源的影响，社会工作效率降低、医疗保健成本增加，估计每年造成33亿美元的损失。在许多低收入和中等收入国家，沙门氏菌所造成的经济和社会损失更是难以测算。此外，沙门氏菌也是动物饲料和宠物食品中的主要致病性微生物。这些饲料的安全性不仅关乎动物健康，还关乎动物源食品或处理宠物食品的人员健康。

为了减少与食品和饲料产品相关的沙门氏菌爆发和疾病，需要从农场到餐桌进行多环节的检测和控制。目前，沙门氏菌检测和鉴定的标准方法主要包括细菌分离和生化鉴定。基于培养法的细菌分离虽然结果可信度高，但耗时费力（通常需要5-7天）且在肠杆菌科下不同物种之间可发生交叉生化反应。以聚合酶链反应（PCR）为代表的高灵敏度和特异性的核酸扩增方法已广泛应用于沙门氏菌等病原微生物的检测。然而，检测结果的判断主要依赖于传统的琼脂糖凝胶电泳检测，由于需使用含有毒性的核酸染料等试剂，实验安全性有待提高。实时荧光定量PCR技术等能够在不使用有毒试剂的情况下对靶标进行定量检测，但由于仪器和试剂成本较高而未能在基层和实际检验工作中广泛使用。因此，亟需开发一种能够提高沙门氏菌检出率，缩短检测时间，不需要昂贵的设备和试剂的分子检测方法以有效防控沙门氏菌的传播。

随着纳米材料与技术的发展，磁性微球（磁珠）成为分子细胞生物学研究、分子诊断、免疫诊断及细胞分选中极为重要的工具和核心原材料。MagBeadsTM磁性微球系列是东纳生物的明星产品，其采用经典的核壳结构设计制造，内核为聚合物微球，外层为磁性物质，最外层采用特殊聚合物修饰，具有尺寸分布均一、表面负载量高、极短的磁响应时间、高的分散稳定性等特点，可以快速、高效地从样本中分离出待测物，极大地提高检测效率。目前MagBeadsTM系列磁性微球已广泛应用于核酸提取、DNA捕获与传感技术、PCR产物纯化、测序产物纯化、核酸转染、抗体纯化、细胞分选、特定蛋白分离、化学发光检测、模拟酶等诸多领域，获得众多知名的大学、研究机构与临床诊断实验室研究人员的广泛好评。

图1：MagBeadsTM系列磁性微球

基于东纳生物研发团队在MagBeadsTM系列磁性微球的研究基础，东南大学生物医学工程学院研究人员与东纳生物合作开发出一种PCR产物磁珠法纯化联合快速荧光定量检测试剂盒（PCR-LFIA），使用磁珠去除PCR产物中的引物二聚体，使用荧光微球作为荧光信号放大器，确保检测的灵敏度和准确度。使用配套检测平台Nanoeasy 1700，可快速实现检测结果数字化定量。该试剂盒在保持PCR特异性的基础上，灵敏度可比普通PCR高2~3个数量级，与荧光定量PCR相当，且不涉及有毒试剂。仪器简便、易于携带，通过互联网可实时共享测试结果。PCR-LFIA检测法快速，灵敏，特异且安全，在疾病诊断、食品检验和环境微生物监测方面具有广泛的应用潜力，尤其适合即时诊断（POCT）应用。

图2：快速荧光定量检测平台Nanoeasy 1700和系列试剂盒

在宠物病原微生物检测研究的基础上，项目组研究人员以沙门氏菌（Salmonella spp.）为检测对象，基于沙门氏菌特异性保守基因bcf设计扩增引物，优化出LFIA的最佳工作反应体系（100 µL）和反应时间（2 min）。经18株细菌标准株验证，PCR-LFIA法能特异性地检测出沙门氏菌。检测灵敏度为6×100 CFU/mL（纯培养物）或6×102 CFU/mL（人工粪便感染物），且与常规培养法在分离样品中的检测结果一致（7.1％阳性，6/85），Cut-off值为175。检测结果通过Sanger测序和BLAST进一步验证。从PCR步骤开始整个过程仅需约80分钟。

研究成果已被2019 IEEE 19th International Conference on Nanotechnology（IEEE-NANO）收录，相关成果已经申请国家发明专利。

图3：PCR-LFIA法检测沙门氏菌示意图

图4：PCR-LFIA法检测沙门氏菌方法的建立. A，PCR产物纯化试剂盒在沙门氏菌扩增产物上的应用结果；B，通过暗场成像观察PCR产物纯化试剂盒的纯化效果；C，快速荧光定量检测平台测试PCR产物纯化结果

图5：PCR-LFIA法检测沙门氏菌方法的灵敏度测试. A，PCR结果使用琼脂糖凝胶电泳验证；B，快速荧光定量检测平台读取PCR结果；C，梯度稀释的样品对应的荧光值标准曲线

图6：PCR-LFIA法检测沙门氏菌方法的特异性测试.

图7：PCR-LFIA法检测沙门氏菌人工粪便感染物灵敏度测试.

图8：PCR-LFIA法检测分离样品中沙门氏菌的结果

参考文献

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