抗体中和TNF-α诱导杀伤L929细胞

1、材料

L-929 细胞系（ATCC Cat# CCL-1）

培养基：RPMI1640+10%FBS。

检测培养基：RPMI1640+2%FBS。

96孔板（平底）（Costar Cat.No.3595）

放线菌素D，500ug/ml 等分-80度冻存（避光）。

MTT溶液：（Sigma Cat. No. M5655）5mg/ml 储液（PBS稀释），室温避光保存。

MTT裂解液：20%SDS或50%DMF。

2、仪器

吸管和移液器

恒湿培养箱

96孔微孔检测分光光度计

3、持续时间

孵育时间48小时（见速查表）

测定样品准备时间1小时

4、实验步骤

(1) 使用检测培养基制备L929悬液，调整细胞浓度为3.5×105/ml，每孔加100ul细胞悬液。37度 5%CO2 恒湿培养箱培养过夜。

(2) 另一块稀释板中每孔加50ul检测培养基。

(3) 使用两倍的连续稀释液从第3排到第12排依次稀释功能级别的抗细胞因子抗体（见速查表标准范围），留1,2排不加。

(4) 2排到12排每孔加50ul重组细胞因子和样品（浓度见速查表，第二排是细胞因子和指示细胞组），1排是只有细胞的对照组。

(5) 37度 5%CO2 恒湿培养箱培养2小时。

(6) 将50ul的抗原抗体混合液加到包含细胞的对应孔中。

(7) 用检测培养基稀释放射菌素D储液为4ug/ml的工作液，每孔加50ul工作液。

(8) 37度 5%CO2 恒湿培养箱培养24小时。

(9) 每孔加10ul MTT溶液（5mg/ml），孵育4小时。

(10)每孔加50ul MTT 裂解液，孵育过夜。

(11)570-650nm 读板。

(12)绘制标准曲线分析数据。