ELISA Ready Set Go标准实验方案

注意：

1.试验中使用特定试剂盒的标准品和抗体，不建议不同试剂盒产品调换，因为可能影响结果准确性。

2.标准曲线孔建议做2-3个复孔。

3.稀释用的缓冲液中不能含有叠氮化钠，因为其可以灭活辣根过氧化物酶。

标准品稀释（如下图）

1.按照C of A说明使用检测稀释液配制浓度为500pg/ml 的标准品溶液。

2.在高亲和ELISA板子中从B1和B2开始到H1和H2每孔分别加入100ul检测稀释液。

3.取200ul的浓度为500pg/ml的标准品加入到A1和A2两个孔中。

4.用排枪从A1和A2两个孔中吸取100ul加入到对应的B1和B2中，吹吸混合均匀，那么 B1和B2标准品浓度为250pg/ml。

5.从B1和B2中吸取100ul加入到C1和C2孔中，混匀，那么C1和C2孔标准品浓度为125pg/ml。

6.按照步骤4和5的方法倍比稀释到H1和H2两孔。H1和H2孔中标准品的浓度是4pg/ml，体积为200ul，取100ul弃掉。届时每个孔标准品的体积均为100ul。

注意：4到6步骤稀释速度要快，避免时间过长，建议使用多通道排枪进行。

7.设置A3和A4为空白对照（只加100ul稀释液），为了避免胡克效应的影响，我们建议可以采用A1和A12作为空白对照孔，而不设置样品或标准品。

结果计算：（需要从标准品OD值拟合出来方程来推算样品的细胞因子的含量）。

1.计算标准品，空白和样品孔平均OD值。

2.样品OD值减去空白孔平均OD值。

3.利用软件拟合出4参数的对数标准曲线，也可以使用描点的方法在坐标中描绘出X轴为标准品浓度，Y轴为平均OD值的各个点，然后大致拟合出相应的曲线。最佳的方法是使用回归分析的方法拟合出标准曲线。

4.利用标准曲线拟合的公式去计算样品中细胞因子的浓度。

5.如果在实验前样品经过稀释，则结果需要乘于稀释倍数。

储存和稳定性说明

1.EB的ELISA试剂盒若按照说明书储存保质期为6个月。

2.试剂盒提供冻结的标准品20ul/瓶，收到后请立即冻存与-80度冰箱，可保存6个月；使用时融化离心1分钟，可避免标准品损失。请避免将标准品分装和反复冻融。每瓶标准品只能用一次，剩余失效。稀释标准品步骤请参照说明书第一部分。

3.ELISA板子请室温储存，其他试剂4度储存即可。

实验材料：

功能纯化级别的捕获抗体。

结合生物素的检测抗体。

标准品。

10×ELISA包被缓冲液。

5×检测稀释液。

抗生物素的辣根过氧化物酶。

TMB底物。

高亲和力96孔板（NUNC Maxisorp flat-bottom or Corning Costar 9018）。

1×PBS+0.05%吐温20（或者ELISA洗液 Cat.No. 00-0400）

终止液：1M H3PO4 或者2N H2SO4

仪器

吸管和单通或多通移液器

冰箱

排枪水槽

分光光度计

洗板机

实验流程：

1.使用无菌水将包被液稀释为1×（注意：预先将包被液平衡至室温）。

2.用1×包被液稀释功能级别的包被抗体，包被ELISA板子，每孔100ul，盖板，四度孵育过夜。

3.第二天稀释检测稀释液（双蒸水稀释），吸出板子的捕获抗体溶液，用300ul洗液洗板3-5次，每次浸泡时间不小于1min,吸水纸上排干。

4.200ul检测稀释液封闭板子，盖板，室温孵育1小时。

5.吸去检测稀释液，用300ul洗液洗板3-4次，每次浸泡时间不小于1min,吸水纸上排干。

6.按照上述说明使用1×检测稀释液稀释标准品（严格按照说明书进行）。

7.加100ul样品和标准品到对应的孔中，封板，室温孵育2个小时或4度过夜（高灵敏度）。

8.孵育期间，按照说明书准备检测抗体。

9.吸去样品，用300ul洗液洗板5次，每次浸泡时间不小于1min,吸水纸上排干。

10.每孔加100ul检测抗体，封板，室温孵育1个小时。

11.孵育期间，按照说明书准备抗生物素的HRP溶液。

12.每孔加100ul抗生物素的HRP溶液，封板，室温孵育0.5个小时（避免溶液中有叠氮钠，因为会影响HRP活性）。

13.吸去溶液，用300ul洗液洗板3-4次，每次浸泡时间不小于1min,吸水纸上排干。

14.每孔加100ulTMB溶液，封板，室温孵育15min（注意：TMB要预先平衡至室温）。

15.加50ul终止液终止。

16.加终止液后30min内检测，450nm读板。

附录：缓冲液配制方法

1X PBS: 

　80.0 g NaCl

　11.6 g Na2HPO3

　2.0 g KH2PO4

　2.0 g KCl

　以 1 L DI H2O定容 并调节 pH 值为 7.0

ELISA Wash Buffer:

　1 L 的1X PBS

　0.5 mL Tween-20

　此外, 也可以购买ELISA洗液干粉 (eBio cat. # 00-0400) ，用1 L DI H2O重悬。