流式表面抗原染色方法

方案A：细胞悬液的表面抗原染色。

方案B：一步法胞内蛋白染色（细胞核）。

小贴士：

1、流式抗体要储存于避光4度，严格避免冻融。

2、流式抗体使用前要离心3min，避免贴壁盖的损失，请勿斡旋混匀。

3、避免细胞成团，以免堵塞流式细胞仪。

4、eFluor纳米晶体抗体参照该品说明进行改善。

方案A: 细胞悬液的表面抗原染色

实验材料：

15×75mm圆底流式管或96孔板

直标一抗或纯化抗体

二抗（可选）

抗小鼠CD32/16抗体（eBioscience Cat. No. 14-0161）

人FCR结合抑制剂（eBioscience Cat. No. 14-9161）

流式染色液（eBioscience Cat. No. 00-4222）可自行配制

eFluor纳米晶体抗体染色液（eBioscience Cat. No. 00-3222；可选）

7-AAD活度染色液（eBioscience Cat. No. 00-6993）或PI染色液（eBioscience Cat. No. 00-6990）

实验流程： 

1、按照样品细胞制备方案制备悬浮细胞，调整浓度为2×107/ml。

2、（可选）封闭FCR介导的非特异性反应：

小鼠：染色之前加0.5ug-1ug/100ul CD16/32抗体，孵育20min。

人类：染色之前加20ul 人FCR结合抑制剂孵育20min。

3、等分细胞悬液，每管50ul，再补加50ul染色液。

4、按照抗体说明书加入适量抗体，轻弹混匀。

5、直标抗体。

方案B：淋巴组织细胞制备

实验材料：

60×15mm 的组织培养皿

[5ml 注射器

细胞过滤器（尼龙网过滤）

eBioscience® 流式染色缓冲液 (eBioscience Cat. No. 00-4222)

15ml或50ml的离心管。

注意：

Foxp3 Fixation/Permeabilization Concentrate 1份加3份 Diluent 稀释为工作液（1:4稀释）。

实验方案： 

1、按照流式样品要求制备单细胞悬液。

2、按照流式表面染色方法标记CD3和CD4。缓冲液洗涤一次，离心完全弃上清。斡旋分散细胞。

3、加1ml Foxp3 Fixation/permeabilization 工作液，斡旋固定细胞。室温或四度避光孵育30-60min（小鼠样品最长可以四度固定18小时）。

4、每管加2ml 1×permeabilization buffer。

5、300g 室温离心5min,弃上清。

6、2ml 1×permeabilization buffer重悬细胞。

7、300g 室温离心5min,弃上清。

8、加100ul 1×permeabilization buffer 重悬细胞后，加入二抗FOXP3 （或其他胞内抗原抗体），室温避光孵育20min。

9、2ml 1×permeabilization buffer洗一次，300g 室温离心5min,弃上清。

10、加2ml 流式染色液，300g 室温离心5min,弃上清。

11、适量流式染色液重悬，即可上机检测。同行对照依照上述步骤进行。软件分析结果。