T细胞体外活化

方案A: 刺激活化小鼠外周T细胞方案。 

方案B：刺激活化人PBMC方案。

方案A: 刺激活化小鼠外周T细胞方案

1、材料

1×PBS无菌

Anti-mouse CD3e, Clone 145-2C11 (Functional Grade, Cat. No. 16-0031, or Purified, Cat. No. 14-0031) Anti-mouse CD28, Clone 37.51 (Functional Grade, Cat. No. 16-0281)

RPMI1640完全培养基：

　　900 mL RPMI-1640 (Hyclone Cat. No. SH30027.02)

　　100 mL FBS (Hyclone Cat. No. SH30151.03) Heat inactivated (10% final)

　　1 mL 2-mercaptoethanol (Gibco BRL Cat. No. 21985-023)

　　10 mL L-Glutamine (Hyclone Cat. No. SH30034.01)

　　Antibiotic cocktail (可选)

小鼠脾脏或淋巴结单细胞悬液（无菌）

带盖的无菌96孔培养板（Costar Cat. No. 3596）

刀豆蛋白A（ConA, Sigma Cat. No. C5275）

2、仪器

吸管和移液器

37度CO2培养箱

台式低温离心机

3、实验持续时间 

包被抗体时间：2-18小时

制备脾脏单细胞悬液时间：20分钟

处理细胞培养时间：20分钟

培养时间：2-4天

4、实验方案 

1）抗体预包被：

(1) 用无菌PBS配制5-10ug/ml 的CD3e抗体溶液，根据实验设计和复孔的数目计算所需抗体工作液的量。例如包被48孔，则需要抗体体积为2.6ml。

(2) 每孔加CD3e抗体溶液50ul，空白孔加PBS。

(3) 盖板，四度孵育过夜或37度孵育2小时。

(4) 除去抗体溶液，无菌PBS洗涤2次，即可加细胞悬液。

2）添加细胞：

(1) 取小鼠脾脏制备单细胞悬液，按照方案除去红细胞。 (2) 完全培养基定容细胞为106/ml（该密度是TCR介导T细胞活化实验的最佳浓度；亦可依据自己实验经验摸索最佳浓度）。

(3) 每孔加200ul细胞悬液（可加1-4ug/ml，ConA刺激）。

(4) 加入可溶性的CD28抗体，2ug/ml。

(5) 37°C, 5% CO2培养箱培养2-4天，具体增殖的最佳时间依赖实验者摸索。

(6) 收获细胞，继续其他方面的实验。

方案B：刺激活化人PBMC方案

1、材料

1×PBS无菌

Anti-human CD3e, Clone OKT3Functional Grade, Cat. No. 16-0037, or Clone HIT3a, Cat. No. 16-0039)

Anti-human CD28, Clone 28.2 (Functional Grade, Cat. No. 16-0289)

RPMI1640完全培养基：

　　900 mL RPMI-1640 (Hyclone Cat. No. SH30027.02) 

　　100 mL FBS (Hyclone Cat. No. SH30151.03) Heat inactivated (10% final) 

　　1 mL 2-mercaptoethanol (Gibco BRL Cat. No. 21985-023) 

　　10 mL L-Glutamine (Hyclone Cat. No. SH30034.01) 

　　Antibiotic cocktail (可选)

无菌PBMC细胞悬液

带盖的无菌96孔培养板（Costar Cat. No. 3596）

2、仪器

吸管和移液器

37度CO2培养箱

台式低温离心机

3、持续时间

包被抗体时间：2-18小时

制备脾脏单细胞悬液时间：30分钟

处理细胞培养时间：20分钟

培养时间：2-4天

4、实验步骤

1）抗体预包被：

(1) 用无菌PBS配制5-10ug/ml 的CD3e抗体溶液，根据实验设计和复孔的数目计算所需抗体工作液的量。例如包被48孔，则需要抗体体积为2.6ml。

(2) 每孔加CD3e抗体溶液50ul，空白孔加PBS。

(3) 盖板，四度孵育过夜或37度孵育2小时。

(4) 除去抗体溶液，无菌PBS洗涤2次，即可加细胞悬液。

2）添加细胞：

(1) 提取人类PBMC单细胞悬液。

(2) 完全培养基定容细胞为106/ml（该密度是TCR介导T细胞活化实验的最佳浓度；亦可依据自己实验经验摸索最佳浓度）。

(3) 每孔加200ul细胞悬液（可加1-4ug/ml，ConA刺激）。

(4) 加入可溶性的CD28抗体，2ug/ml。

(5) 37°C, 5% CO2培养箱培养2-4天，具体增殖的最佳时间依赖实验者摸索。

(6) 收获细胞，继续其他方面的实验。